Persistenza dell’mRNA del vaccino, del DNA plasmidico, della proteina Spike e della disregolazione genomica per oltre 3,5 anni dopo la vaccinazione con mRNA contro il COVID-19.
Premessa: La biodistribuzione a lungo termine e la persistenza dei componenti dei vaccini a RNA contro il COVID-19 non sono ancora state sufficientemente caratterizzate. Nuove evidenze suggeriscono che l’espressione prolungata della proteina spike, l’RNA residuo e i frammenti di DNA plasmidico possano contribuire alle sindromi post-vaccinazione multisistemiche.
Presentazione del caso: Riportiamo il caso di un uomo di 55 anni che ha ricevuto tre dosi del vaccino a mRNA anti-COVID-19 di Pfizer-BioNTech e ha successivamente sviluppato una disfunzione multiorgano progressiva compatibile con la sindrome post-vaccinazione anti-COVID-19 (PCVS), con interessamento cardiopolmonare, neurologico, muscoloscheletrico, gastrointestinale, autonomico, otorinolaringoiatrico, audiovestibolare, immunitario, oftalmico, dermatologico e psichiatrico. Le manifestazioni cliniche includevano: embolia polmonare; miocardite tardiva confermata da risonanza magnetica; deficit neurocognitivo; neuropatia delle piccole fibre; disfunzione autonomica; mialgia; coinvolgimento pancreatico e gastrointestinale cronico; peggioramento dell’acufene con ipoacusia neurosensoriale; disfagia e disfonia; disturbi oftalmici; infiammazione dermatologica cronica; e ansia/depressione. Il caso è stato valutato attraverso un’indagine clinica longitudinale e multidisciplinare di eccezionale ampiezza, che ha incluso analisi molecolari, immunologiche, genetiche, proteomiche, trascrittomiche e tissutali, intrapresa per caratterizzare i meccanismi della malattia ed escludere eziologie alternative.
Valutazione diagnostica : Dopo oltre 40 accessi al pronto soccorso e oltre 200 visite specialistiche ambulatoriali, il paziente è stato sottoposto a oltre 100 esami di laboratorio non di routine e oltre 100 esami di imaging/funzionali. Questa valutazione ha escluso sistematicamente meccanismi eziologici sottostanti di natura infettiva, autoimmune, reumatologica, endocrina, genetica, ematologica, neoplastica, tossica/farmaco-correlata, cardiovascolare/vascolare, metabolica e neurologica primaria. I test sono rimasti in gran parte non diagnostici. Dopo la diagnosi di miocardite, si è sospettata una possibile infezione asintomatica non documentata/non diagnosticata, manifestatasi come Long COVID, e si è proceduto con esami sierologici; i risultati inattesi hanno indotto un’estensione dei test immunologici e tissutali per la ricerca di componenti della proteina Spike e del vaccino. Gli anticorpi contro la nucleocapside del SARS-CoV-2 sono risultati negativi in cinque momenti distinti, compresi tra 809 e 1433 giorni dopo la vaccinazione, come confermato da tre laboratori indipendenti. Il paziente rimane negativo al test della nucleocapside, con livelli persistentemente elevati di anticorpi anti-proteina spike (4.553 U/mL) a 1.433 giorni dall’ultima vaccinazione.
Raccolta dei campioni e metodi analitici : Campioni di sangue e tessuto cutaneo sono stati prelevati in diversi momenti tra 852 e 1.364 giorni dopo l’ultima vaccinazione con mRNA anti-COVID-19 di Pfizer-BioNTech. I compartimenti biologici analizzati includevano plasma, esosomi circolanti, cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e tessuto cutaneo. I campioni sono stati valutati in diversi laboratori indipendenti utilizzando varie metodologie analitiche, tra cui ELISA, immunoistochimica automatizzata, RT-PCR, PCR standard con conferma mediante sequenziamento Sanger, sequenziamento dell’intero genoma, profilazione trascrittomica e spettrometria di massa quantitativa.
Risultati molecolari circolanti: A 852 giorni dalla vaccinazione, i test immunologici su sangue hanno identificato la proteina S1 del SARS-CoV-2 rilevabile all’interno di sottogruppi di monociti classici e non classici con anomalie associate di citochine e marcatori immunitari. A 1.173 giorni dalla vaccinazione, l’ELISA ad alta sensibilità ha rilevato la proteina spike di Wuhan libera nel plasma (129,0 ± 4,1 fg/mL) e negli esosomi circolanti (11,6 ± 0,1 fg/mL). A 1.284 giorni, la RT-PCR ha identificato l’mRNA della proteina spike derivato dal vaccino all’interno degli esosomi circolanti, mentre l’RNA delle PBMC è rimasto negativo dopo l’estrazione trattata con DNasi e la PCR specifica per ampliconi mirata a tre regioni ORF della proteina spike (S1-S3). La profilazione sierologica effettuata a 1.173 e 1.284 giorni dalla vaccinazione ha dimostrato concentrazioni persistentemente elevate di IgG4 specifiche per la proteina spike (rispettivamente 354,4 ± 22,4 ng/mL e 320,2 ± 4,4 ng/mL), coerenti con una stimolazione antigenica in corso e una risposta sbilanciata verso la tolleranza immunitaria.
Risultati molecolari e istopatologici a livello tissutale: Biopsie cutanee seriali a 1.160, 1.249 e 1.364 giorni dalla vaccinazione, tutte prelevate dalla cute del tronco in aree di malattia di Grover clinicamente attiva, sono risultate negative per la nucleocapside e hanno dimostrato una deposizione persistente della proteina spike nelle cellule endoteliali e nei macrofagi mediante immunoistochimica automatizzata con correlazione istopatologica. La proteina spike è stata riscontrata anche nelle fibre nervose a 1.364 giorni. La biopsia cutanea a 1.364 giorni conteneva molteplici elementi di DNA plasmidico, tra cui sequenze del gene spike (S1-S3), ori1/ori2 e l’enhancer SV40, confermando la ritenzione duratura del DNA derivato dal vaccino nel tessuto somatico mediante amplificazione PCR con elettroforesi su gel di agarosio e sequenziamento Sanger.
Analisi multi-omica : l’analisi delle varianti strutturali del sequenziamento dell’intero genoma a 1.277 giorni dalla vaccinazione ha rivelato un’instabilità genomica diffusa, con grandi duplicazioni e delezioni che interessano EGFR, MYC, ERBB2 ed ETV6/RUNX1, mentre il confronto RNA-DNA ha mostrato varianti solo RNA nei pathway ribosomiali, NMD, small-RNA, epigenetici e TP53. La profilazione trascrittomica del sangue intero ha evidenziato stress ossidativo, attivazione vascolare e fragilità nucleare. La proteomica urinaria mediante spettrometria di massa quantitativa ha confermato l’infiammazione sistemica con iperattivazione del complemento (CFH), squilibrio redox (PRDX1) e risposte anticorpali sostenute, supportate dagli alleli di rischio HLA-B07:02 e DRB1*11:04.
Conclusione: Questo caso documenta la più lunga persistenza in vivo mai riportata di mRNA derivato dal vaccino, frammenti di DNA plasmidico e proteina spike a seguito di vaccinazione con mRNA, con rilevamento riproducibile in diversi laboratori indipendenti, compartimenti biologici distinti e sistemi di rilevamento molecolare complementari, per oltre 3,5 anni dopo l’ultima dose. La proteina spike, le sequenze di mRNA della proteina spike e gli elementi dello scheletro plasmidico sono stati identificati sia nelle cellule immunitarie che nei tessuti somatici, con continua assenza di proteina nucleocapsidica SARS-CoV-2 o anticorpi, escludendo di fatto un’infezione pregressa come fonte. La convergenza di queste osservazioni attraverso campionamenti longitudinali di sangue e tessuti fornisce la prova diretta che il materiale genetico derivato dal vaccino a mRNA e i suoi prodotti proteici tradotti possono persistere in vivo per anni dopo la somministrazione. Parallelamente, le analisi multi-omiche hanno rivelato una persistente instabilità genomica e una disregolazione trascrittomica per oltre 3,5 anni dopo la vaccinazione, suggerendo che il materiale derivato dal vaccino persistente possa essere associato ad alterazioni a lungo termine nei percorsi genomici e molecolari dell’ospite. Questi dati mettono in discussione le ipotesi prevalenti riguardanti la rapida degradazione e la breve durata dell’attività biologica dei componenti dei vaccini a mRNA e sottolineano la necessità di studi longitudinali controllati per determinare la prevalenza, i meccanismi e le conseguenze cliniche del materiale persistente derivato dal vaccino.
Persistenza senza precedenti di mRNA vaccinale, DNA plasmidico, proteina Spike e disregolazione genomica per oltre 3,5 anni dopo la vaccinazione con mRNA contro il COVID-19.pdf
Fonte: https://zenodo.org/records/18460099
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